Bactérias endofíticas do morangueiro antagônicas ao fungo Pestalotiopsis longisetula.

A pestalotiose tem sido, nos últimos três anos, a principal doença da cultura do morango em todas as regiões produtoras do sul de Minas Gerais. A aplicação de fungicidas disponíveis no mercado não tem controlado o fungo Pestalotiopsis longisetula. Isolamento de microrganismos endofíticos de plantas cultivadas em sistemas orgânico e convencional da região foi realizado com o objetivo de selecionar bactérias com potencial antagônico ao fungo patogênico. Como resultados desse estudo foram obtidos 25 isolados capazes de inibir o crescimento daquele fungo. Das bactérias isoladas as mais promissoras foram a P2C1-3 e a P2F1-1 que controlaram o crescimento do fungo em aproximadamente 40%.

Análise proteômica comparativa dos componentes da superfície celular e do secretoma de Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, infecção fúngica oportunista com altas taxas de mortalidade afetando, principalmente, pacientes com neutropenia profunda e prolongada. Durante o processo de invasão e disseminação características desta infecção sistêmica, os conídios do fungo inalados e não eliminados pelas células do sistema imune inato diferenciam-se em hifas que, por sua vez, são angioinvasivas. Pouco se conhece sobre as moléculas da parede celular envolvidas na patogênese do A. fumigatus e/ou secretadas por este patógeno. Neste contexto, este trabalho procura ampliar o entendimento desta doença através do estudo de proteínas diferencialmente expressas na superfície de A. fumigatus durante a morfogênese. Foi utilizada uma abordagem proteômica e foram estudados extratos de superfície de células de A. fumigatus em diferentes estágios durante o processo de filamentação. Estas células foram denominadas, de acordo com o tempo de cultivo e a morfologia, como: TG6h (tubo germinativo), H12h ou H72h (hifas). As proteínas de superfície celular foram extraídas, a partir de células intactas, por tratamento brando com o agente redutor DTT (ditiotreitol). Observou-se que o perfil funcional das proteínas expressas por H12h e H72h foi similar, com exceção de proteínas relacionadas à resposta ao estresse, enquanto o perfil para TG6h apresentou diferenças significativas para vários grupos funcionais de proteínas quando comparado às hifas. Desta forma, foram realizados experimentos de proteômica diferencial entre tubo germinativo (TG6h) e a hifa madura (H72h), pela técnica de DIGE (differential gel electrophoresis). Os resultados revelaram que entre as proteínas diferencialmente expressas, aquelas relacionadas às vias de biossíntese e outras denominadas multifuncionais encontraram-se superexpressas em TG6h. Em relação às proteínas de resposta a estresse, observou-se que algumas HSPs eram mais expressas neste morfotipo, enquanto a MnSOD, relativa à resposta ao estresse oxidativo, era mais abundante na hifa. Com exceção da PhiA, integrante da parede celular, as proteínas identificadas como diferencialmente expressas na superfície do A. fumigatus não possuem sinal para secreção identificável, enquadrando-se nas proteínas atípicas de superfície. Foi verificada a integridade da membrana celular após tratamento com DTT, bem como a marcação por biotina das proteínas extraídas, o que comprovou sua localização superficial na célula fúngica. Hipóteses de que estas proteínas sejam endereçadas à parede celular por via secretória alternativa sustentam estes dados. Estas evidências foram confirmadas pelo fato de não terem sido encontradas as mesmas proteínas da superfície na análise do secretoma do A. fumigatus. Além disso, todas as proteínas caracterizadas no secretoma apresentavam sinal de secreção determinado pelo FunSecKB (www.proteomics.ysu.edu/secretomes/fungi.php). A análise do secretoma foi realizada utilizando-se a cepa selvagem AF293 e a mutante ∆prtT, mutante para um fator de transcrição que atua na regulação da secreção de proteases. Os resultados revelam a ALP1 como expressa na cepa selvagem, assim como outras proteases importantes para virulência e desenvolvimento da célula fúngica, estando suprimidas quando o gene prtT foi deletado.

Molecular genomics of a genetic code alteration

The genetic code is not universal. Alterations to its standard form have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes and demolished the dogma of an immutable code. For instance, several Candida species translate the standard leucine CUG codon as serine. In the case of the human pathogen Candida albicans, a serine tRNA (tRNACAGSer) incorporates in vivo 97% of serine and 3% of leucine in proteins at CUG sites. Such ambiguity is flexible and the level of leucine incorporation increases significantly in response to environmental stress. To elucidate the function of such ambiguity and clarify whether the identity of the CUG codon could be reverted from serine back to leucine, we have developed a forced evolution strategy to increase leucine incorporation at CUGs and a fluorescent reporter system to monitor such incorporation in vivo. Leucine misincorporation increased from 3% up to nearly 100%, reverting CUG identity from serine back to leucine. Growth assays showed that increasing leucine incorporation produced impressive arrays of phenotypes of high adaptive potential. In particular, strains with high levels of leucine misincorporation exhibited novel phenotypes and high level of tolerance to antifungals. Whole genome re-sequencing revealed that increasing levels of leucine incorporation were associated with accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and loss of heterozygozity (LOH) in the higher misincorporating strains. SNPs accumulated preferentially in genes involved in cell adhesion, filamentous growth and biofilm formation, indicating that C. albicans uses its natural CUG ambiguity to increase genetic diversity in pathogenesis and drug resistance related processes. The overall data provided evidence for unantecipated flexibility of the C. albicans genetic code and highlighted new roles of codon ambiguity on the evolution of genetic and phenotypic diversity.

Codon ambiguities as a mechanism to alter the genetic code in Saccharomyces cerevisiae

Although the genetic code is generally viewed as immutable, alterations to its standard form occur in the three domains of life. A remarkable alteration to the standard genetic code occurs in many fungi of the Saccharomycotina CTG clade where the Leucine CUG codon has been reassigned to Serine by a novel transfer RNA (Ser-tRNACAG). The host laboratory made a major breakthrough by reversing this atypical genetic code alteration in the human pathogen Candida albicans using a combination of tRNA engineering, gene recombination and forced evolution. These results raised the hypothesis that synthetic codon ambiguities combined with experimental evolution may release codons from their frozen state. In this thesis we tested this hypothesis using S. cerevisiae as a model system. We generated ambiguity at specific codons in a two-step approach, involving deletion of tRNA genes followed by expression of non-cognate tRNAs that are able to compensate the deleted tRNA. Driven by the notion that rare codons are more susceptible to reassignment than those that are frequently used, we used two deletion strains where there is no cognate tRNA to decode the rare CUC-Leu codon and AGG-Arg codon. We exploited the vulnerability of the latter by engineering mutant tRNAs that misincorporate Ser at these sites. These recombinant strains were evolved over time using experimental evolution. Although there was a strong negative impact on the growth rate of strains expressing mutant tRNAs at high level, such expression at low level had little effect on cell fitness. We found that not only codon ambiguity, but also destabilization of the endogenous tRNA pool has a strong negative impact in growth rate. After evolution, strains expressing the mutant tRNA at high level recovered significantly in several growth parameters, showing that these strains adapt and exhibit higher tolerance to codon ambiguity. A fluorescent reporter system allowing the monitoring of Ser misincorporation showed that serine was indeed incorporated and possibly codon reassignment was achieved. Beside the overall negative consequences of codon ambiguity, we demonstrated that codons that tolerate the loss of their cognate tRNA can also tolerate high Ser misincorporation. This raises the hypothesis that these codons can be reassigned to standard and eventually to new amino acids for the production of proteins with novel properties, contributing to the field of synthetic biology and biotechnology.

Identification of molecules and pathways regulating mistranslation in Candida albicans

Candida albicans is the major fungal pathogen in humans, causing diseases ranging from mild skin infections to severe systemic infections in immunocompromised individuals. The pathogenic nature of this organism is mostly due to its capacity to proliferate in numerous body sites and to its ability to adapt to drastic changes in the environment. Candida albicans exhibit a unique translational system, decoding the leucine-CUG codon ambiguously as leucine (3% of codons) and serine (97%) using a hybrid serine tRNA (tRNACAGSer). This tRNACAGSer is aminoacylated by two aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs): leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) and seryl-tRNA synthetase (SerRS). Previous studies showed that exposure of C. albicans to macrophages, oxidative, pH stress and antifungals increases Leu misincorporation levels from 3% to 15%, suggesting that C. albicans has the ability to regulate mistranslation levels in response to host defenses, antifungals and environmental stresses. Therefore, the hypothesis tested in this work is that Leu and Ser misincorporation at CUG codons is dependent upon competition between the LeuRS and SerRS for the tRNACAGSer. To test this hypothesis, levels of the SerRS and LeuRS were indirectly quantified under different physiological conditions, using a fluorescent reporter system that measures the activity of the respective promoters. Results suggest that an increase in Leu misincorporation at CUG codons is associated with an increase in LeuRS expression, with levels of SerRS being maintained. In the second part of the work, the objective was to identify putative regulators of SerRS and LeuRS expression. To accomplish this goal, C. albicans strains from a transcription factor knock-out collection were transformed with the fluorescent reporter system and expression of both aaRSs was quantified. Alterations in the LeuRS/SerRS expression of mutant strains compared to wild type strain allowed the identification of 5 transcription factors as possible regulators of expression of LeuRS and SerRS: ASH1, HAP2, HAP3, RTG3 and STB5. Globally, this work provides the first step to elucidate the molecular mechanism of regulation of mistranslation in C. albicans.

Transformação genética em cevada por bombardeamento de partículas

A presente Tese de Doutorado objetivou: (1) definir um método eficiente de transformação genética, por bombardeamento de partículas, para a obtenção de plantas transgênicas de cultivares brasileiras de cevada e (2) identificar gene(s) codificante(s) de quitinase(s) potencialmente capaz(es) de conferir resistência ao fungo patogênico de cevada Bipolaris sorokiniana. Culturas de calos obtidos a partir de escutelos imaturos das cultivares Brasileiras de cevada MN-599 e MN-698 (Cia. de Bebidas das Américas, AMBEV) foram bombardeadas com partículas de tungstênio e avaliadas quanto à expressão do gene repórter gusA através de ensaios histoquímicos de GUS e quanto ao efeito dos bombardeamentos na indução estruturas embriogênicas e regeneração de plantas. As condições de biobalística analisadas incluíram a região promotora regulando a expressão de gusA, tipo e pressão de gás hélio de dois aparelhos de bombardeamento, distância de migração das partículas, número de tiros e a realização de pré e pós-tratamento osmótico dos tecidos-alvo. No presente trabalho foram obtidos um número bastante alto de pontos azuis por calo, a indução de calos embriogênicos e embriões somáticos em uma freqüência de até 58,3% e a regeneração de 60 plantas, sendo 43 de calos bombardeados. As melhores condições observadas foram o promotor e primeiro íntron do gene Adh de milho (plasmídeo pNGI), o aparelho de bombardeamento “ Particle Inflow Gun” (PIG) utilizando-se a distância de migração de partículas de 14,8 cm, dois tiros disparados por placa e a realização de tratamento osmótico dos explantes com 0,2 M de manitol e 0,2 M de sorbitol 4-5 horas antes e 17-19 horas depois dos bombardeamentos. Das 43 plantas obtidas de calos bombardeadas, 3 apresentaram atividade de GUS na base das suas folhas. A utilização de primers sintéticos definidos a partir de genes de quitinases descritos na literatura em PCRs resultou na amplificação de dois fragmentos de aproximadamente 700 e 500 pb a partir de DNA total das cvs. MN-599 e MN-698 de cevada e um fragmento, com aproximadamente 500 pb, a partir do DNA total do isolado A4c de Trichoderma sp. Estes fragmentos foram purificados dos géis de agarose e diretamente seqüenciados de forma manual e automática. Os fragmentos de 700 e 500 pb amplificados do genoma da cultivar MN-599 foram identificados como genes de quitinases de cevada e o fragmento de 500 pb do isolado A4c de Trichoderma sp. não apresentou homologia com seqüências conhecidas de quitinases depositadas no EMBL/GenBank. A utilização de novos pares de primers, representando seqüências conservadas de quitinases do fungo Metarhizium anisopliae, resultou na amplificação de 3 fragmentos a partir do DNA total do isolado A4b de Trichoderma sp., que estão sendo purificados para realização de seqüenciamento.

Modelagem matemática da doença do caranguejo letárgico via ondas viajantes

Pós-graduação em Biometria - IBB

Detecção do Paracoccidioides spp. em amostras ambientais e diferenciação do complexo P. brasiliensis da espécie P. lutzii por Nested PCR e hibridização in situ

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Bibliotecas na saúde… e a saúde nas bibliotecas?

Em arquivos e bibliotecas a presença de fungos é considerada nefasta pelas suas implicações na conservação e leitura de documentos históricos e pela sua associação a problemas de saúde sentidos pelos funcionários e utentes que frequentam estes locais. De acordo com alguns autores, os problemas de saúde mais reportados por funcionários em Bibliotecas e Arquivos são dermatite, rinite, alergias e asma. Embora revestida de inegável importância, existem poucos estudos internacionais sobre a temática e, em Portugal, a contaminação fúngica em ambiente arquivístico e em bibliotecas é ainda muito pouco conhecida. O estudo realizado em quatro Arquivos Portugueses teve como objectivo conhecer a contaminação fúngica, contribuindo para a análise da qualidade do ar interior desses espaços e sua comparação com estudos internacionais. Para isso foram recolhidas amostras de ar e de superfícies e estas foram analisadas por métodos clássicos de cultura e, quando necessário, por métodos de biologia molecular. A avaliação foi feita quantitativa e qualitativamente, considerando os requisitos legais em vigor. No que respeita à análise do ar, o número de unidades formadoras de colónias (UFC)/m3 nunca excedeu as 500 (limite legislado), tendo sido verificada contaminação interior em todos os locais estudados. Comparativamente aos estudos realizados anteriormente em contextos semelhantes foram encontrados níveis elevados de contaminação por leveduras nas amostras de ar analisadas em Arquivos Portugueses. Não foi identificado nenhum fungo patogénico neste estudo, mas em quase todas as amostras estavam presentes fungos potencialmente toxinogénicos. Dentro do grupo dos Aspergillus, o A.versicolor mostrou predominância, tendo este fungo reconhecidas capacidades de emissão de micotoxinas em ambiente de interior. A inclusão de amostras de superfície revelou-se vital para conhecer todo o espectro fúngico existente em cada um dos locais estudados, incluindo a detecção de Stachybotrys chartarum e a do fungo potencialmente queratinofílico, Chrysosporium carmichaelli. Tanto para a saúde como para a conservação, o recente estudo realizado em quatro arquivos permitiu retirar importantes conclusões e reforçar a necessidade de vigilância, sendo também útil para a definição de padrões de qualidade no campo do património cultural.

DETEÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS EM FOLHAS DE OLIVEIRA INFETADAS COM OLHO-DE-PAVÃO

Os fungos endofíticos, que colonizam naturalmente os tecidos de plantas, têm vindo a crescer de importância em termos de pesquisa e aplicações no âmbito da proteção das plantas. Todavia, a sua presença nos tecidos da oliveira ainda permanece bastante desconhecida. Dessa forma, com o objetivo de identificar e relacionar a presença de fungos endofíticos com o fungo patogénico Spilocaea oleaginea, agente causal da doença olho-de-pavão na oliveira, durante a primavera e verão de 2013 colheram-se folhas das cultivares Cobrançosa, Picual e Galega, que apresentavam lesões características da presença da doença, em quatro olivais localizados em diferentes regiões do Alentejo. Após a extração do DNA total e subsequente PCR com primers universais para a região ITS (internal transcribed spacer), foram sequenciados e analisados dez clones de cada cultivar. De acordo com as bases de dados Fungal Barcode e NCBI foi identificada a presença de fungos endofíticos pertencentes a oito famílias, nomeadamente, Botryosphaeriaceae, Dothioraceae, Leptosphaeriaceae, Mycosphaerellaceae, Phaeosphaeriaceae, Pleosporaceae, Sclerotiniaceae e Venturiaceae.

Possibilidade de controle da murcha de Fusarium do tomateiro com isolados de Fusarium oxysporum não patogênico.

O trabalho teve por objetivo verificar o efeito dos isolados de Fusarium oxysporum não patogênicos (143/1, 233, 233/1, 245, 245/1, 251, 251/2 e 257) no controle da murcha de Fusarium causada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, raça 2 (isolados C-21A, TO11 e TO245) em plântulas de tomateiro cv. Viradoro. O sistema radicular de plântulas de tomateiro, com 30 dias de idade, foi imerso na suspensão de inóculo dos isolados de F. oxysporum não patogênicos na concentração de 106 conídios mL-1 e em seguida as mudas foram transplantadas para substrato de cultivo.

Efeito da inoculação com fungo micorrizico arbuscular na transferencia de N em consorciação sorgo granifero e soja.

1999

Espalhamento e eficiencia de uma formulacao de fungo a base de oleo adjuvante emulsionavel.

O objetivo deste trabalho foi quantificar duas vantagens (bom espalhamento e eficiencia) do uso de formulacoes de fungo em oleos adjuvantes emulsionaveis (OAE) em relação a outras formulacoes utilizadas no controle biologico de pragas. O espalhamento de conidios do fungo Metarhizium anisopliae, formulados em diferentes concentracoes ( 1%, 5%, 10%, 15%, 20% e 25%) de OAE Codacide, foram comparados entre si, com uma formulacao-padrao de agua com 0,05% Tween 80, com uma formulacao em oleo puro de amedoim e formulacao da mistura de oleos minerais (50% Shellsol T e 50% Ondina EL) sobre superficie hidrofobica de papel siliconado. Em seguida, realizou-se um bioensaio para comparacao da eficiencia das diferentes formulacoes de fungo, exceto a mistura de oleos minerais sobre larvas do coleoptero Tenebrio molitor. Os resultados demonstraram que os primeiros 30 minutos são suficientes para que as formuladas atinjam o espalhamento maximo. Quando a concentracao de OAE aumenta, o espalhamento tambem melhora. As formulacoes oleosas espalham mais que as formulacoes a base de agua. Concentracoes de OAE entre 5% e 25% aumenta, a infectividade do fungo e são mais eficientes que o fungo em agua com Tween e tão eficientes quanto as oleosas.

Evolução da população do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia -isolado PcMR, após inoculação, no solo e na raiz do tomateiro cultivado em estufa

O fungo Pochonia chlamydospoia é um potencial agente de controlo biológico dos nemátodes-das-galhas-radiculares. Com este trabalho, pretendeu-se avaliar a eficácia de inoculações de clamidósporos no solo, no estabelecimento de uma população do fungo no solo e na raiz de tomateiro em estufa com níveis de densidade iguais ou superiores aos considerados como necessários para um eficaz controlo dos nematodes-das-galhas-radiculares. Ao longo de dois anos de ensaio, fórum efetuadas inoculações do isolado PcMR e avaliada a densidade de fungo no solo e na raiz, As inoculações efetuadas permitiram estabelecer uma população de P. chlamydosporia no solo e atingir os valores de densidade pretendidos. No entanto, os valores pretendidos para colonização da raiz pelo fungo foram atingidos apenas no primeiro ano. Foi igualmente demonstrada a capacidade do fungo em se manter no solo durante longos períodos de tempo mesmo na ausência de cultura e em condições adversas de humidade e temperatura. /ABSTRACT: Pochonia chlamydosporia is a potential root-knot nematode biological control agent. The aim of this work was to evaluate the effectiveness of chlamydospore inoculations at the soil, for the establishment at both soil and greenhouse tomato root, of a fungus population in density levels equal or superior to those considered as needed for an effective control of root-knot nematode. Along two years, several inoculations using the Portuguese isolate PcMR were made and the density of fungus at the soil and roots studied. These inoculations allowed the establishment of a population of P. chlamydosporia at the soil and achieve the desired density values. However, only in the first year of assay, the desired values of root colonization by fungus were achieved. lt was also demonstrated that P. chlamydosporia can survive for itself at the soil for a long period of time even in the absence of plant culture and in adverse moist and temperature conditions.

Infection mechanism of Diplodia corticola

Diplodia corticola is regarded as the most virulent fungus involved in cork oak decline, being able to infect not only Quercus species (mainly Q. suber and Q. ilex), but also grapevines (Vitis vinifera) and eucalypts (Eucalyptus sp.). This endophytic fungus is also a pathogen whose virulence usually manifests with the onset of plant stress. Considering that the infection normally culminates in host death, there is a growing ecologic and socio-economic concern about D. corticola propagation. The molecular mechanisms of infection are hitherto largely unknown. Accordingly, the aim of this study was to unveil potential virulence effectors implicated in D. corticola infection. This knowledge is fundamental to outline the molecular framework that permits the fungal invasion and proliferation in plant hosts, causing disease. Since the effectors deployed are mostly proteins, we adopted a proteomic approach. We performed in planta pathogenicity tests to select two D. corticola strains with distinct virulence degrees for our studies. Like other filamentous fungi D. corticola secretes protein at low concentrations in vitro in the presence of high levels of polysaccharides, two characteristics that hamper the fungal secretome analysis. Therefore, we first compared several methods of extracellular protein extraction to assess their performance and compatibility with 1D and 2D electrophoretic separation. TCA-Acetone and TCA-phenol protein precipitation were the most efficient methods and the former was adopted for further studies. The proteins were extracted and separated by 2D-PAGE, proteins were digested with trypsin and the resulting peptides were further analysed by MS/MS. Their identification was performed by de novo sequencing and/or MASCOT search. We were able to identify 80 extracellular and 162 intracellular proteins, a milestone for the Botryosphaeriaceae family that contains only one member with the proteome characterized. We also performed an extensive comparative 2D gel analysis to highlight the differentially expressed proteins during the host mimicry. Moreover, we compared the protein profiles of the two strains with different degrees of virulence. In short, we characterized for the first time the secretome and proteome of D. corticola. The obtained results contribute to the elucidation of some aspects of the biology of the fungus. The avirulent strain contains an assortment of proteins that facilitate the adaptation to diverse substrates and the identified proteins suggest that the fungus degrades the host tissues through Fenton reactions. On the other hand, the virulent strain seems to have adapted its secretome to the host characteristics. Furthermore, the results indicate that this strain metabolizes aminobutyric acid, a molecule that might be the triggering factor of the transition from a latent to a pathogenic state. Lastly, the secretome includes potential pathogenicity effectors, such as deuterolysin (peptidase M35) and cerato-platanin, proteins that might play an active role in the phytopathogenic lifestyle of the fungus. Overall, our results suggest that D. corticola has a hemibiotrophic lifestyle, switching from a biotrophic to a necrotrophic interaction after plant physiologic disturbances.This understanding is essential for further development of effective plant protection measures.